pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Zeocin是碧云天自行研发的用于方便地插入靶向目的基因的sgRNA (Single guide RNA)并使用CRISPR/Cas9基因编辑(Gene editing)系统进行基因编辑的质粒。本质粒表达绿色荧光蛋白EGFP (Enhanced green fluorescent protein)便于观察转染效率或感染效果，同时携带了Zeocin抗性(Bleo抗性)，方便后续进行多克隆或单克隆稳定细胞株的筛选。本质粒在插入靶向目的基因的sgRNA后，可以直接转染细胞进行基因编辑，也可以用于包装慢病毒后感染细胞或组织进行基因编辑。 慢病毒(Lentivirus)是以HIV-1 (人类免疫缺陷1型病毒)为基础发展起来的病毒载体系统。它能高效地将目的基因(蛋白质编码序列或小RNA)导入动物或人的原代细胞或细胞系。慢病毒的宿主范围广，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达，被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、microRNA研究以及活体动物实验中[1-3]。本慢病毒载体进行了多方面的改造，删除了慢病毒绝大部分的致病基因，并使包装后的病毒失去了自我复制能力，安全性大大提升，并能有效提高外源基因的表达效果。本质粒可以和pCMV-VSV-G (D8215)以及pCAG-dR8.9 (D8216)配合使用进行慢病毒的包装。 本质粒经过BsmBⅠ (CGTCTC(1/5)^)限制性核酸内切酶消化后，切除图谱中标示的filler，把设计好的靶向特定基因的sgRNA序列经退火后形成的双链寡核苷酸片段连接到载体中，就能构建成相应的用于基因编辑的质粒了。 本质粒中使用了人源化脓性链球菌Cas9 (Humanized S. pyogenes Cas9, hSpCas9)。hSpCas9是一种能在sgRNA的引导下切割双链DNA的核酸内切酶。在sgRNA的引导下，Cas9剪切基因靶位点产生双链DNA断裂，随后在细胞DNA修复过程中会导致基因靶位点处的插入、删除或替换，从而可能产生移码突变，导致目的基因的缺失突变。当设计的sgRNA的基因靶位点相对比较靠近5'端的时候，就能导致通常所说的基因敲除。本质粒中在hSpCas9的C端添加了核定位信号(Nuclear localization signal, NLS)，能够有效确保hSpCas9定位在细胞核，从而有效提高基因编辑效率。 本质粒表达的Cas9带有Flag标签，可通过Flag抗体(AF0036/AF5051/AF519)检测Cas9的表达。同时本质粒中Cas9-Flag和EGFP之间通过P2A连接。EGFP与Cas9-Flag同时翻译，可以呈现很强的绿色荧光，可以在荧光显微镜下非常便捷地观察到本质粒的表达情况(图1)，并且也方便使用流式细胞仪分选阳性细胞。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切，而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游Cas-Flag的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG)，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列，可提高剪切效率。 图1.碧云天pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Zeocin质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片，右侧为荧光照片。 本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和博莱霉素(Bleomycin)抗性。在大肠杆菌中呈现氨苄青霉素抗性。本质粒转染哺乳动物细胞后，可使用Zeocin (博莱霉素) (ST1450)筛选多克隆或单克隆细胞株。 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Zeocin质粒的主要信息如下： Feature Nucleotide Position CMV promoter 1-199 5' LTR (truncated) 217-397 HIV-1 Ψ 444-569 RRE 1062-1295 cPPT/CTS 1822-1939 U6 promoter 1990-2230 filler 2235-4119 gRNA scaffold 4120-4195 EF-1α core promoter 4257-4468 Kozak sequence 4487-4496 Cas9 4493-8596 nucleoplasmin NLS 8597-8644 FLAG 8645-8668 P2A 8678-8734 EGFP 8735-9454 WPRE 9470-10058 Factor Xa site 9941-9952 3' LTR (ΔU3) 10130-10363 bGH poly(A) signal 10395-10619 f1 ori 10665-11093 SV40 promoter 11107-11436 SV40 ori 11287-11422 EM7 promoter 11484-11531 BleoR 11550-11924 SV40 poly(A) signal 12054-12175 M13 rev 12224-12240 lac operator 12248-12264 lac promoter 12272-12302 CAP binding site 12317-12338 ori 12626-13214 AmpR 13385-14245 AmpR promoter 14246-14350 CMV enhancer 14616-14995 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Zeocin质粒(14996bp)的图谱如下： pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Zeocin的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D8305 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Zeocin.pdf pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Zeocin中没有的酶切位点包括： AarI AbsI AscI AsiSI AspI AxyI BoxI Bse21I BsiWI BstEII BstHPI BstPI BstPAI Bsu36I I-CeuI I-PpoI I-SceI KspAI MreI PaeR7I PalAI Pfl23II PflFI PI-PspI PI-SceI PshAI PspEI PspLI PspXI PsyI RgaI RsrII Rsr2I SbfI SdaI SfaAI SfiI Sfr274I SgfI SgsI SlaI SrfI Sse8387I Tth111I XhoI pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Zeocin中的单酶切位点包括： Acc65I G`GTAC,C 1984 MauBI CG`CGCG,CG 11586 AfeI AGC|GCT 4483 NarI GG`CG,CC 401 AgeI A`CCGG,T 4470 NheI G`CTAG,C 4208 AvrII C`CTAG,G 11421 NotI GC`GGCC,GC 907 BamHI G`GATC,C 8669 PacI TTA,AT`TAA 1980 BbvCI CC`TCA,GC 1183 PasI CC`CWG,GG 6262 BmtI G,CTAG`C 4212 PluTI G,GCGC`C 404 BspDI AT`CG,AT 3277 PmeI GTTT|AAAC 10373 BsrGI T`GTAC,A 9444 PuvI CG,AT`CG 13828 BstBI TT`CG,AA 2849 SacII CC,GC`GG 9973 BstZ17I GTA|TAC 12186 SfoI GGC|GCC 402 ClaI AT`CG,AT 3277 SgrAI CR`CCGG,YG 11664 EcoRI G`AATT,C 4202 SgrDI CG`TCGA,CG 14379 EcoRV GAT|ATC 6346 SnaBI TAC|GTA 14971 FseI GG,CCGG`CC 11826 SpeI A`CTAG,T 14630 FspI TGC|GCA 13680 StuI AGG|CCT 11420 KasI G`GCGC,C 400 SwaI ATTT|AAAT 3632 KpnI G,GTAC`C 1988 XbaI T`CTAG,A 4476 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Zeocin质粒可使用的测序引物序列如下： sgRNA的测序引物hU6-F primer: 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3' pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Zeocin的全序列信息:D8305 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Zeocin序列.txt

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注意事项：本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。