pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo是碧云天自行研发的用于方便地插入靶向目的基因的sgRNA (Single guide RNA)并使用CRISPR/Cas9基因编辑(Gene editing)系统进行基因编辑的质粒。本质粒表达绿色荧光蛋白EGFP (Enhanced green fluorescent protein)便于观察转染效率或感染效果，同时携带了Neo抗性(G418抗性)，方便后续进行多克隆或单克隆稳定细胞株的筛选。本质粒在插入靶向目的基因的sgRNA后，可以直接转染细胞进行基因编辑，也可以用于包装慢病毒后感染细胞或组织进行基因编辑。 慢病毒(Lentivirus)是以HIV-1 (人类免疫缺陷1型病毒)为基础发展起来的病毒载体系统。它能高效地将目的基因(蛋白质编码序列或小RNA)导入动物或人的原代细胞或细胞系。慢病毒的宿主范围广，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达，被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、microRNA研究以及活体动物实验中[1-3]。本慢病毒载体进行了多方面的改造，删除了慢病毒绝大部分的致病基因，并使包装后的病毒失去了自我复制能力，安全性大大提升，并能有效提高外源基因的表达效果。本质粒可以和pCMV-VSV-G (D8215)以及pCAG-dR8.9 (D8216)配合使用进行慢病毒的包装。 本质粒经过BsmBⅠ (CGTCTC(1/5)^)限制性核酸内切酶消化后，切除图谱中标示的filler，把设计好的靶向特定基因的sgRNA序列经退火后形成的双链寡核苷酸片段连接到载体中，就能构建成相应的用于基因编辑的质粒了。 本质粒中使用了人源化脓性链球菌Cas9 (Humanized S. pyogenes Cas9, hSpCas9)。hSpCas9是一种能在sgRNA的引导下切割双链DNA的核酸内切酶。在sgRNA的引导下，Cas9剪切基因靶位点产生双链DNA断裂，随后在细胞DNA修复过程中会导致基因靶位点处的插入、删除或替换，从而可能产生移码突变，导致目的基因的缺失突变。当设计的sgRNA的基因靶位点相对比较靠近5'端的时候，就能导致通常所说的基因敲除。本质粒中在hSpCas9的C端添加了核定位信号(Nuclear localization signal, NLS)，能够有效确保hSpCas9定位在细胞核，从而有效提高基因编辑效率。 本质粒表达的Cas9带有Flag标签，可通过Flag抗体(AF0036/AF5051/AF519)检测Cas9的表达。同时本质粒中Cas9-Flag和EGFP之间通过P2A连接。EGFP与Cas9-Flag同时翻译，可以呈现很强的绿色荧光，可以在荧光显微镜下非常便捷地观察到本质粒的表达情况(图1)，并且也方便使用流式细胞仪分选阳性细胞。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切，而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游Cas-Flag的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG)，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列，可提高剪切效率。 图1.碧云天pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片，右侧为荧光照片。 本质粒含有卡那霉素(Kanamycin)和新霉素(Neomycin)抗性。在大肠杆菌中呈现卡那霉素抗性。本质粒转染哺乳动物细胞后，可使用G418 (ST081)筛选多克隆或单克隆细胞株。 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo质粒的主要信息如下： Feature Nucleotide Position CMV promoter 1-199 5' LTR (truncated) 217-397 HIV-1 Ψ 444-569 RRE 1062-1295 cPPT/CTS 1822-1939 U6 promoter 1990-2230 filler 2235-4119 gRNA scaffold 4120-4195 EF-1α core promoter 4257-4468 Kozak sequence 4487-4496 Cas9 4493-8596 nucleoplasmin NLS 8597-8644 FLAG 8645-8668 P2A 8678-8734 EGFP 8735-9454 WPRE 9470-10058 Factor Xa site 9941-9952 3' LTR (ΔU3) 10130-10363 bGH poly(A) signal 10395-10619 f1 ori 10665-11093 SV40 promoter 11107-11436 SV40 ori 11287-11422 EM7 promoter 11484-11531 NeoR/KanR 11550-12344 SV40 poly(A) signal 12474-12595 M13 rev 12644-12660 lac operator 12668-12684 lac promoter 12692-12722 CAP binding site 12737-12758 ori 13046-13634 CMV enhancer 14104-14483 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo质粒(14484bp)的图谱如下： pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D8301 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo.pdf pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo中没有的酶切位点包括： AarI AbsI AscI AsiSI AxyI BoxI BpvUI Bse21I BsiWI BstEII BstHPI BstPI BstPAI Bsu36I Eco81I Eco91I EcoO65I FseI FspAI HpaI I-CeuI I-PpoI I-SceI KspAI MauBI MreI PaeR7I PalAI Pfl23II PI-PspI PI-SceI Ple19I PshAI PspEI PspLI PspXI PvuI RgaI RigI SbfI SdaI SfaAI SfiI Sfr274I SgfI SgrAI SgrDI SgsI SlaI SrfI Sse8387I XhoI pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo中的单酶切位点包括： Acc65I G`GTAC,C 1984 NotI GC`GGCC,GC 907 AfeI AGC|GCT 4483 NruI TCG|CGA 596 AgeI A`CCGG,T 4470 PacI TTA,AT`TAA 1980 AvrII C`CTAG,G 11421 PasI CC`CWG,GG 6262 BamHI G`GATC,C 8669 PflFI GACN`N,NGTC 11796 BbvCI CC`TCA,GC 1183 PmeI GTTT|AAAC 10373 BmtI G,CTAG`C 4212 RsrII CG`GWC,CG 12194 BspDI AT`CG,AT 3277 SacII CC,GC`GG 9973 BsrGI T`GTAC,A 9444 SexAI A`CCWGG,T 11188 BssHII G`CGCG,C 474 SmaI CCC|GGG 11444 BstBI TT`CG,AA 2849 SnaBI TAC|GTA 14459 BstZ17I GTA|TAC 12606 SpeI A`CTAG,T 14118 ClaI AT`CG,AT 3277 StuI AGG|CCT 11420 EcoRI G`AATT,C 4202 SwaI ATTT|AAAT 3632 EcoRV GAT|ATC 6346 TspMI C`CCGG,G 11442 KpnI G,GTAC`C 1988 Tth111I GACN`N,NGTC 11796 MluI A`CGCG,T 9455 XbaI T`CTAG,A 4476 NheI G`CTAG,C 4208 XmaI C`CCGG,G 11442 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo质粒可使用的测序引物序列如下： sgRNA的测序引物hU6-F primer: 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3' pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo的全序列信息:D8301 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo序列.txt

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注意事项：本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。